Kromatografija biljnih pigmenata – “Utrka” molekula iz lista špinata


2. Kromatografija biljnih pigmenata – „utrka“ molekula iz lista špinata

Biologija i kemija neodoljiv su tandem koji doprinosi otkrivanju svijeta koji nas okružuje, nerazdvojni baš kao Ljepotica i zvijer, Stanlio i Olio ili pak Messi i Neimar, dobitna su kombinacija znanosti koja nas podsjeća da se sve može kad se male ruke slože.

A složit ćete se, puno se toga trebalo dogoditi, s biološkog, kemijskog i evolucijskog aspekta kako bi nastao list – naizgled jednostavna i nama tako svakodnevna tvorevine. U ovoj će nam radionici list poslužiti kao materijal iz kojeg ćemo izolirati biljne pigmente, molekule čiju je važnost za život na Zemlji nemoguće prenaglasiti.

2.1. Što je i čemu služi kromatografija?

Zadatak 1. Pažljivo pročitaj tekst te odgovori na pitanja ili nadopuni rečenice pravilnim razvrstavanjem sljedećih pojmova: čiste tvari, homogene, heterogene, smjesa, fizikalna i kemijska svojstva
Sve oko nas, i živi i neživi svijet, izgrađuju tvari, koje se međusobno razlikuju po fizikalnim i kemijskim svojstvima. U prirodi se tvari najčešće nalaze kao smjese dviju ili više tvari, a rjeđe kao čiste tvari. Smjesu tvari definiramo kao sustav koji se sastoji od dviju ili više čistih tvari koje međusobno kemijski ne reagiraju, a svaka tvar u smjesi zadržava svoja fizikalna i kemijska svojstva.

Prisjetimo se samo da je i zrak koji udišemo smjesa tvari kao i tlo potrebno za rast biljaka, naših veličanstvenih tvornica hranjivih tvari i kisika, a i plavetnilo morske vode pravi je primjer smjese tvari. Voćni sokovi riznica su različitih korisnih tvari, a rude prirodno bogatstvo i smjesa različitih minerala. Pregršt je primjera, treba se samo sjetiti i mlijeka i krvi, hrane za ptice, pijeska i različitih stijena, a i čovjek je tvorac različitih smjesa, od žbuke do kocke za juhu. Možete li se i vi sjetiti još nekih primjera?

Smjese tvari mogu biti homogene i heterogene. Homogene smjese su smjese u kojima se golim okom, povećalom ili mikroskopom ne mogu razlikovati sastojci smjese. Svaki dio homogene smjese jednak je po građi i sastavu. Heterogena smjesa je smjesa u kojoj se sastojci mogu vidjeti golim okom ili mikroskopom. Ima promjenljiv sastav i svojstva.

Ni u homogenim, a niti u heterogenim smjesama pojedini sastojci nisu međusobno kemijski vezani pa ih možemo razdvojiti, pročistiti ili dokazati odgovarajućim fizikalnim postupcima kao što su filtracija, destilacija, prekristalizacija, sublimacija, ekstrakcija i kromatografija. O vrsti smjese ovisi postupak kojim se mogu razdvojiti sastojci smjese.

a)   Tvari u prirodi dijelimo u dvije velike skupine,   __________________________               (elementarne tvari i kemijski spojevi) i .

b)Smjesu tvari definiramo kao sustav koji se sastoji od_____________. Svaka tvar u smjesi zadržava svoja_____________ svojstva.

c)U prirodi se tvari najčešće nalaze kao_____________dviju ili više tvari, a rjeđe kao          _____________ .                                                                                   .

d)Možeš li se prisjetiti još nekih primjera smjesa s kojima se svakodnevno susrećeš?

e)Smjese tvari mogu biti _____________ i ______________. Kako se mogu razlikovati?

f)Koji se postupci mogu koristiti za razdvajanje otapala od otopljene tvari?

2.2. O kromatografiji i biljnim pigmentima

Metoda koju ćemo koristiti u ovoj radionici zove se kromatografija i pomoći će nam razdvojiti pigmente koji se nalaze u listu špinata.

Zadatak 2. Pažljivo pročitaj tekst te odgovori na pitanja ili nadopuni rečenice pravilnim razvrstavanjem sljedećih pojmova:

M. S. Cvet, graphein, zeleni, crveni chroma, apsorbira, boja, pigmentum, reflektira, plavi, bojila

Nomen est omen, sugeriraju nam klasični jezici značenje pojma kromatografija koji se sastoji od dviju grčkih riječi: chroma označava boju, a grafein znači pisati.

Kromatografija je metoda razdvajanja tvari iz smjese temeljena na njihovu različitom afinitetu prema pokretnoj fazi (nekom otapalu, npr. vodi ili acetonu) i stacionarnoj fazi (npr. papiru).

To je postupak razdvajanja čistih tvari iz homogenih, tekućih ili plinovitih smjesa. Temelji se na različitoj brzini putovanja iona ili molekula nošenih otapalom po nepokretnoj fazi. Pojedini sastojci smjese, zbog različitih fizikalnih procesa, putuju različitom brzinom po nepokretnoj (stacionarnoj) fazi i na taj način se odijele.

Utrkuju se te molekule baš poput pravih maratonaca, a najdalje stižu najuporniji i najpripremljeniji. U kromatografskom smislu to su one molekule koje su najbrže nošene otapalom, tj. svojom su masom i fizikalno-kemijskim svojstvima prilagođene „lakom“ prolasku stacionarnom fazom.

Prvu kromatografsku tehniku izumio je ruski botaničar Mihail Semjonovič Cvet početkom 20. stoljeća. Primijenio je kromatografsku metodu za odjeljivanje otopine (smjese) biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu usitnjenim kalcijevim karbonatom (CaCO3). Odijeljeni sastojci vidjeli su se na koloni kao obojene vrpce po kojima je ta tehnika dobila ime. Lako je moguće da je znanstvenik metodu nazvao i u vlastitu čast, budući da prezime Cvet u ruskom jeziku označava boju.

Pigmenti ili bojila su tvari različitog kemijskog sastava koji daju boju različitim tvorevinama u živom svijetu jer selektivno apsorbiraju i reflektiraju svjetlost određenih valnih duljina. Ime im potječe od latinske riječi pigmentum, koja označava boju. Tako primjerice tvar plave boje upija (apsorbira) zeleni i crveni spektar sunčevog zračenja, a odbija (reflektira) plavi dio spektra te ju zato i vidimo plavo obojeno.

a)Nomen est omen, sugeriraju nam klasični jezici značenje pojmova: , što na grčkom jeziku znači boja i_____________ , što znači pisati.

b)Prvi je, početkom 20. stoljeća izumio kromatografsku tehniku_____________. On je tom metodom odijelio_____________ .

c)Pigmenti ili_____________su tvari različitog kemijskog sastava, a određuju_____________, jer selektivno_____________određenih valnih duljina. Ime im potječe od latinske riječi_____________,koja označava_____________ .

d)Tako primjerice tvar plave boje_____________(upija)_____________spektar sunčevoga zračenja, a_____________(odbija)_____________dio spektra te ju zato i vidimo plavo obojeno.

Zadatak 3. Prisjeti se što još znaš o biljnim pigmentima.

a)Navedi nekoliko molekula koje se ubrajaju u pigmente karakteristične za biljni svijet i njihove uloge. Gdje se nalaze u biljnoj stanici?

b)Što određuje boju pojedinom biljnom pigmentu?

Zadatak 4. Razvrstaj i napiši na crte na slici sljedeće pojmove: kloroplast, apsorbirana svjetlost, reflektirana svjetlost, propuštena svjetlost.

untitled

Zadatak 5. Biljni pigmenti i naše zdravlje

a)Koje su boje pigmenti?

Klorofil:                                                             ;

Karotenoidi: karoten                                           ; ksantofil                              

Flavonidi: antocijan                                  

 

b)Potraži na internetskim stranicama važnost navedenih biljnih pigmenata za zdravlje čovjeka. Za svaki pigment preporuči dvije do tri biljke koje bismo trebali konzumirati jer sadrži navedeni pigment.

Klorofil:

Djelovanje na zdravlje:                                                                                                                                                                                                       

Primjeri biljaka:                                                                                             

Karotenoidi:

Djelovanje na zdravlje:                                                                                                                                                                                                       

Primjeri biljaka:                                                                                             

Flavonidi (antocijan):

Djelovanje na zdravlje:                                                                                                                                                                                                       

Primjeri biljaka:                                                                                              .

c)U koju se skupinu biljnih pigmenata svrstavaju likopen i antoksantin i koje su boje?

likopen: _____________________________; boja:                                           

antoksantin: __________________________; boja:                                          

2.3. Tijek eksperimenta

Priroda je često zagonetna i složena, ali nikad komplicirana i uvijek prekrasna u svojoj jednostavnosti. A posve je jednostavan i ovaj pokus kojim se mogu razdvojiti pigmenti prisutni u listu špinata.

 

2.3.1. Pribor i kemikalije:

 

Za izvođenje pokusa kromatografije bit će potrebno pripremiti: kromatografski ili običan filter papir, epruvetu ili mala menzura, pluteni čep kroz koji je provučena mala žica ili spajalica, Erlenmeyerova tikvica, škarice, svježi listovi špinata (ili trpuca, blitve, maslačka), kovanica, kromatografsko otapalo [medicinski benzin (100 ml), petroleter (25 ml) i aceton (20 ml)], ravnalo i kalkulator (slika 1). Spajalica na svom zakrivljenom dijelu služi kao držač kromatografskog papira koji se unosi u epruvetu s otapalom

screenshot-at-sep-27-20-09-48

Slika 1. Pribor i kemikalije potrebni za izvođenje kromatografije

2.3.2. Opis postupka

1.Kromatografski papir izreži u traku odgovarajuće duljine i širine. Na donjem dijelu trake škaricama formiraj oštar vrh. Bitno je da traka kromatografskog papira dimenzijama odgovara veličini epruvete/menzure u koju se treba unijeti tako da vrh trake (papira) doseže dno epruvete (Slika 2).

001

Slika 2. Oblikovanje kromatografskog papira za provođenje kromatografije

2. Zatim je potrebno pigmente iz lista prenijeti na kromatografski papir (traku). U tome jednostavno može pomoći i novčić, kovanica, uz pomoć koje možeš direktno nanijeti ekstrakt lista na kromatografski papir.

Usitni list špinata i manji komadić lista špinata presavij nekoliko puta te kovanicu utiskuj u taj list koji je položen iznad kromatografske trake. Na taj se način iz stanica lista oslobađaju pigmenti i apsorbiraju na kromatografski papir. Budite pažljivi s utiskivanjem kovanice kako ne biste napravili rupu na kromatografskom papiru.

3. Nakon nanošenja dovoljne količine pigmenta na kromatografski papir, pričekaj nekoliko minuta da se kromatografska traka (papir) u potpunosti osuši.

4. U epruvetu ulij malo otapala, tako da visina otapala u epruveti bude oko 1 cm.

5. Zatim kromatografski papir unesi u epruvetu s otapalom. Kao držač kromatografskog papira služi pluteni čep kroz koji je provučena mala žica ili spajalica. (slika 3).

002

Slika 3. Pravilno postavljena kromatografska traka u epruveti ili menzuri.

Bitno je da dio kromatografskog papira (vrh trake) koji je uronjen u otapalo nije u dodiru s dijelom kromatografskog papira na koji je nanesen pigment, tj. dio trake s pigmentom ne doseže otapalo unutar epruvete.

6. Razdvajanje pigmenata iz lista špinata ovdje se izvodi uzlaznom kromatografskom tehnikom na kromatografskom papiru pomoću otapala koje služi za odvajanje pigmenata, a postupak traje oko 20 minuta.

Mobilna faza (otapalo) prolazi kroz stacionarnu fazu (pore papira) zbog kapilarnih sila. Kako otapalo difundira, ono putuje, tj. uspinje se po papiru i povlači za sobom pojedine pigmente iz ekstrakta lista koje putuju različitim brzinama i zaustavljaju se na različitim mjestima. Tamo gdje se zaustave, ostaju obojene zone („mrlje“) na papiru (slika 4). Tako nastaje kromatogram (slika 5). Različite obojene zone, dokazuju prisutnost pojedinih pigmenata u ekstraktu lista.

003

Slika 4. Kromatografija ekstrakta pigmenata iz listova špinata

004

Slika 5. Prikaz kromatograma ekstrakta biljnih pigmenta iz listova špinata

7. Iz kromatograma se lako može odrediti vrijednost retencijskog faktora (Rf) ili faktor zadržavanja. To je svojstvo svakog spoja i služi za njegovu identifikaciju (slika 6).

005

Slika 6. Postupak određivanja retencijskog faktora (Rf)

8. Na kraju eksperimenta počisti za sobom, uredi radni prostor te operi, osuši i pospremi na mjesto korišteni radni pribor.

9.Rezultate pokusa prezentiraj kolegama.

 

2.3.3. Pročitaj, razmisli i odgovori

 1.Koliko se različitih obojenih zona može zamijetiti na tvom kromatografskom papiru? Je li uzorak koji ste stavili na kromatografski papir bila smjesa ili čista tvar? Argumentirajte svoj odgovor.                                                                                                                                                                                                                                                             

2. Što označavaju te zone (mrlje)?          

3. Izračunaj Rf za zonu koja je najbliža fronti otapala f; f je udaljenost (u cm), do koje je stiglo otapalo (pomoću jednadžbe na slici 6).                                                                                                                  

 

Znanstvenici su desetljećima nastojali poboljšati i tehnički unaprijediti izvedbu Cvetove kromatografske metode te se stoga danas kromatografija može primijeniti na različite načine i u različitim inačicama, omogućavajući razdvajanje i veoma sličnih molekula. Primjenjuje u analitičkim laboratorijima u svim granama kemije, u farmaciji i u biokemiji, gdje se koristi za odjeljivanje i identifikaciju različitih tvari, aminokiselina, šećera, lipida, hormona, enzima, vitamina, pigmenata i dr.

4. Navedite razloge zbog kojih je kromatografija poželjna i korisna metoda za razdvajanje pigmenata iz listova špinata? I koji su razlozi zbog kojih se u ovom slučaju nije mogla primijeniti metoda filtracije?                                                                                                                           

 

Osmislile i pripremile: Marija Radić, prof. i Zrinka Pongrac Štimac, prof.